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  • 新稿速递┃红茶菌A4发酵功能饮料的研制
  • 2021-04-15 03:06:51
  • 红茶菌的功效与作用


    红茶菌A4发酵功能饮料的研制

    孙玉坤,李亚霖,赵亮,籍保平,周峰*

    (中国农业大学 食品科学与营养工程学院,植物源功能食品北京市重点实验室,北京,100083)

    摘 要:以红茶茶汤(质量分数0.5%)、蜂蜜(质量浓度6.54%)作为发酵底物,接种本课题组前期分离纯化,并拥有知识产权的红茶菌葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp., A4)10%进行发酵,而研发出一款新的功能性饮料。这株菌代谢产出具有保肝护肝功效的功能因子D-葡萄糖二酸-1,4-内酯(D-Saccharic acid 1,4-lactone monohydrate, DSL)。静置于30 ℃环境下4~5 d得到发酵液,再将发酵液经离心、抽滤、调配、罐装、密封、杀菌等一系列工序,制成有功能性和独特风味的、可以进行工业生产的饮料。经过感官评价确定最终饮料配方为:87.35%发酵原液,12.24%白砂糖,0.16%柠檬酸,0.25%苹果酸。最终通过抗氧化能力的测定,与市售红茶菌发酵饮料进行比较,评定本产品的抗氧化性最佳。

    关键词:红茶菌;发酵;功能饮料;抗氧化

    红茶菌发酵饮料大多以家庭自制为主,市面上鲜有成功产品,其菌株均为混合菌株,由醋酸菌、酵母菌、乳酸菌等多种菌种共同组成,将原料经过生物技术发酵工艺后,代谢产生营养物质,具有一定的保健功能 红茶菌的功效与作用 [4],并赋予产品酸甜相宜、清香爽口的风味[1]。红茶菌是历史悠久的酸性保健饮料,其起源可以追溯到我国古代秦朝时期,但目前红茶菌的研究多在菌种分离鉴定、代谢产物鉴定以及红茶菌抑菌特性上,对红茶菌应用的研究较少[2],而本实验恰为红茶菌研发出新型的饮料。本实验选用的菌种是从红茶菌混合菌株中分离出来的一种单一菌株——葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp., A4),该菌株经过代谢途径特异性高产功能因子D-葡萄糖二酸-1,4-内酯(D-saccharic acid 1,4-lactone monohydrate, DSL)。DSL的保肝护肝功能已被证实,MICHAEL等人在1996年便提出红茶菌的解毒抗癌作用可能是因为红茶菌液中存在DSL[4],在KIM等人的研究中提出,0.03~0.15 mg/mL的DSL具有显著的解毒、抗癌作用[3],特别是预防和治疗癌症方面,对癌症早期具有良好效果[19]。因此,红茶菌A4菌株发酵饮料的研发和其投入工业化生产具有广阔的前景。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂

    纯蜂蜜,蕊悦同仁堂市售;云南滇红红茶,北京吴裕泰茶叶股份有限公司专卖店售;葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp., A4),:ZL 2004 1 0091488.X);食品级碳酸钙,河南思远生物科技有限公司;食品级酵母抽提物,唐山拓普生物科技有限公司;食品级柠檬酸、食品级DL-苹果酸,北京易秀博谷生物科技有限公司;白砂糖,北京闽松经贸有限公司;甲醇(高效气相色谱用)(Methanol),西陇化工股份有限公司;D-葡萄糖二酸1,4-内酯(D-saccharic acid 1,4-lactone monohydrate),美国Sigma公司。

    对比样品:样品A:自主研发产品,红茶菌A4菌种发酵,常温存放至少6个月以上;样品B:红茶菌混合菌株发酵饮料,市售,货架期较长,为12个月,常温保存;样品C:红茶菌混合菌株发酵饮料,市售,货架期较短,为15 d,需0~7 ℃冷藏;样品D:红茶菌混合菌株发酵饮料,市售,声称内含野生沙棘。

    1.2 仪器与设备

    全自动杀菌釜MLS-3020,日本三洋电器有限公司;双人单面净化工作台SW-CJ-2FD,苏州净化设备有限公司;生化培养箱LRH-250,上海一恒科技有限公司;水浴振荡器HZS-H,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;高速台式离心机TDL-5-A,北京市长风仪器仪表公司;Softmax Pr,MD酶标仪SMP500-15275-SWXN, MD, Enterprise;糖度计LB80,广州市铭睿电子科技有限公司;气相色谱仪GC-2010,日本岛津公司;一次性使用无菌注射器1ML 20140408,江苏治宇医疗器材有限公司;微孔滤膜(有机/尼龙66)0.22 μm,津隆。

    1.3 方法

    1.3.1 菌种的驯化与发酵条件

    种子液的制备:先配制液体培养基,4 g葡萄糖(100 g/L),0.4 g酵母浸出物(10 g/L),0.8 g CaCO3(20 g/L),纯净水40 mL,全部使用食品级试剂,pH调制6.8[5]。灭菌后晾凉,在超净工作台中用接种环从斜面接3~4环至液体培养基中。置于30 ℃水浴振荡器中振荡培养24 h,待接种至第1次扩大培养液,接种量为20%。

    第1次与第2次扩大培养:先进行培养液的配制,3.0 g红茶(每升基液应称取5 g),用煮沸的纯净水浸泡3次,每次15 min,最后将3次茶汤混合,共600 mL(第1次扩大培养液用80 mL,第2次扩大培养液用320 mL)制成0.5%红茶茶汤。再加入蜂蜜并溶解,蜂蜜固形物含量为76.4% Bx,加入量为65.4 g/L(根据红茶菌糖利用率最高的情况确定),故称取39.27 g。灭菌备用。第1次与第2次扩大培养各置于30℃水浴振荡器中振荡培养24 h,从第1次扩大培养液接种至第2次扩大培养液中的接种量也为20%。

    发酵条件:发酵基液的配制与第1、2次扩大培养液相同,称取15.0 g红茶,用煮沸的纯净水浸泡3次,每次15 min,最后将3次茶汤混合,共3 L红茶茶汤,加入196.34 g蜂蜜并溶解,从中取2.7 L发酵基液灭菌备用。从第2次扩大培养液中接种至基液,接种量为10%,静置于30 ℃恒温环境中发酵8 d,并隔天取样(第0、2、4、6、8天)。样品于-80 ℃下保存待测。

    1.3.2 灭菌条件

    使用高压灭菌釜,121 ℃,15 min。

    1.3.3 DSL的测定气相色谱条件

    标准品配制:准确称取DSL 100.000 0 mg,并用甲醇定容至10 mL容量瓶中,得到浓度为10 000 g/L。从上述溶液中取5、2、1、0.5、0.1 mL,各自定容至10 mL容量瓶中,得到浓度分别为5 g/L、2 g/L、1 g/L、0.5 g/L、0.1 g/L的标准品。

    样品前处理:取第4天、第8天样品的1号、2号、3号于离心管中3 000 g、15 min离心,取上清液1 mL至干燥小烧杯中,在鼓风干燥箱中以85 ℃烘干,再分别用4 mL甲醇溶解,封口膜密封。将溶液倒入7 mL离心管中3 000 g、15 min离心,再用一次性无菌注射器将上清液吸出于4 mL离心管中,使之通过0.22 μm的滤膜。标记好后放置在-20 ℃下保存待测。

    色谱柱:J&W DB-WAX毛细管色谱柱(30 m×0.250 mm,0.25 μm);升温程序:初始温度50 ℃保持1 min,以12 ℃/min升至220 ℃,保持8 min;载气(N2)流速1.2 mL/min,压力2.4 kPa,进样量1.0 μL;分流比:1∶10。

    1.3.4 总糖的测定

    蒽酮比色法。

    1.3.5 总酸的测定

    电位滴定法。

    1.3.6 感官评价

    选择消费者型感官鉴评人员,做嗜好性感官评价分析,选取的鉴评人员需要自愿进行试饮,身体健康,具有一定语言表达能力,对试样持客观态度[7]。研发者先对正交的实验样品进行试饮,选出5款最有可能被大众所接受的配方,再对这5款饮料进行感官评价。盛装器皿无特殊标记,编号随机且无含义,分发评价标准和评价表,以产品的气味、色泽、风味、形态作为评分依据,以具有独特的产品风味、色泽均一、无杂质、澄澈透明、风味酸甜适宜为评分标准,权重比例算得最高分者作为产品的最终配方。

    表1 红茶菌A4发酵保肝功能性饮料感官评价评分细则

    Table 1 Grading rules of sensory eveluating

    1.3.7 抗氧化活性测定

    1.3.7.1 DPPH自由基清除率测定

    参照丁艳如等[18]的方法,稍作修改。加入样品2 mL、0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL于5 mL带盖离心管中,混匀,用锡纸包裹,反应30 min,在517 nm下用酶标仪测定吸光度值。

    DPPH自由基清除率计算公式如下:

    清除率

    式中:A为加入DPPH和2 mL甲醇测得的吸光度值;Am为加入DPPH和样品测得的吸光度值;An为加入样品和2 mL甲醇测得的吸光度值。

    1.3.7.2 超氧阴离子(·O2-)清除率测定

    参照丁艳如等[18]的方法,稍作修改。加入0.05 mol/L(pH 8.2)的Tris-HCl缓冲液4.5 mL于10 mL带盖离心管中,25 ℃下保温10 min,加入样品1 mL、6 mmol/L的邻苯三酚0.4 mL,混匀,静置反应4 min后,加入8 mol/L的HCl溶液1 mL终止显色反应,在320 nm下用酶标仪测定吸光度值。

    ·O2-清除率计算公式为:

    清除率

    式中:Ad为蒸馏水代替样品时测得的吸光度值;Ap为样品测得的吸光度值;Aq为蒸馏水代替邻苯三酚时测得的吸光度值。

    1.3.7.3 羟基自由基(OH·)清除率测定

    参照丁艳如等[18]的方法,稍作修改。加入样品1 mL、9 mmol/L FeSO4溶液1 mL、9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液于带盖离心管中,最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL启动整个体系,在37 ℃下反应30 min,在512 nm下用酶标仪测定吸光度值。

    OH·清除率计算公式为:

    清除率

    式中:Ak为蒸馏水代替样品测得的吸光度值;Ax为样品测得的吸光度值;Ay为蒸馏水代替H2O2时测得的吸光度值。

    1.4 工艺优化试验说明

    成品需经过图1的主要工艺流程制得。首先获得A4菌种,进行菌种驯化,配制种子液和两次扩大培养液,每阶段均在30 ℃水浴中振荡培养24 h,各阶段间接种量为20%,随后以10%的接种量接种至基液中。基液中红茶质量浓度为0.5%、蜂蜜为6.54%,接种后于30 ℃环境下静置培养4~5 d得到发酵液,再将发酵液经离心、抽滤、调配、罐装、密封等一系列工序,制成有功能性和独特风味的、可进行工业生产的饮料。经过感官评价确定最终饮料配方为:87.35%发酵原液,12.24%白砂糖,0.16%柠檬酸,0.25%苹果酸。

    结果显示DSL的浓度是随发酵时间而逐渐增加的,即发酵后第8天的功能因子浓度比第4天大,而出于感官因素舍弃了第8天的样品。第8天的样品已呈现出发酵的腐败气味,口感酸味过重,蜂蜜风味较淡,而第4~5天样品既有清新的风味,又有酸甜适宜的口感,且未出现不正常味道。

    图1 主要工艺流程
    Fig.1 The main process flowchart

    2 结果与分析

    2.1 总糖含量

    发酵过程中,红茶菌A4菌株对葡萄糖的消耗与培养时间呈线性相关(R2≥0.9)[8],并且红茶菌的发酵主要在前4天完成,多酚含量、糖度、pH都会明显下降,菌体大量繁殖,耗糖量大,酸度增高[8]。8天发酵过程中总糖含量的变化呈明显的线性关系(R2≥0.99)。

    图2 发酵8天内总糖变化趋势
    Fig.2 Result of total sugar

    红茶菌利用发酵液中的糖类物质,产生各种酸、风味物质以及功能因子DSL,所以总糖随发酵时间的延长而总体呈下降趋势。

    2.2 总酸含量

    发酵液中的总酸含量随着发酵时间的增加而增加,经品尝,发酵到第4~5天时酸度比较适口,而发酵时间继续延长则会产生一些其他的代谢产物,使得其口味发生不良变化。

    图3 发酵8天内总酸变化趋势
    Fig.3 Result of total acid

    微生物发酵分解葡萄糖、果糖等碳水化合物,经过2个代谢途径,产生了各种不同的酸性物质,使得发酵液整体呈酸性。一方面赋予了产品酸味,另一方面提高了产品的保藏性能。

    2.3 功能因子DSL含量

    能够代谢产生较多功能因子DSL的菌株较少,而A4菌株正是其中之一,A4菌株代谢葡萄糖(主要)的途径是葡萄糖——葡萄糖醛酸——葡萄糖二酸——葡萄糖二酸1,4-内酯,而次要的途径为糖酵解途径(Embden-Meyerhof-Parnaspathway,EMP),生成丙酮酸,再氧化生成乙酸[9]

    表2 气相色谱标准品数据

    Table 2 Data of gas chromatography standard samples

    表3 发酵8 d内功能因子DSL及感官变化

    Table 3 Changes of concentration of DSL and sense in 8 fermentation days

    通过气相色谱法对样品中的DSL进行分离测定,根据峰面积及标准品曲线,确定不同发酵天数的样品中所含有的DSL浓度,综合其口味及DSL含量,最终确定第4天为发酵终点也是发酵的最佳时间。

    2.4 配方分析与感官评价

    对发酵终止后的产品进行可溶性固形物、总酸的测定,测得第4~5天时发酵液的可溶性固形物含量为5%,总酸含量为2.953 8 g/L,糖酸比约为5∶3。

    为使产品口感酸甜可口,添加白砂糖作为甜味剂,柠檬酸和苹果酸作为酸味剂进行复配,以增强口感丰富度,强化风味。由于柠檬酸(阈值为0.1%~1.0%)的酸感强烈,但是持久性差;而苹果酸的口感较为柔和,回味持久,故两者复配后可得到较为适中的口味,比例为2∶3较为适宜[12-13] 。

    经过10位接受感官评价的评分者对不同配方饮料的品尝及打分,按权重比例算得最高分的组别为第4组配方,评分结果如下。

    表4 五种不同配方的添加剂添加量与感官评价结果

    Table 4 The sensory comparison of five different samples

    表5 红茶菌A4发酵功能性饮料配料表

    Table 5 Ingredients of functional fermented beverage

    2.5 抗氧化活性评价

    将自主研制的红茶菌A4发酵饮料与其他3种市售红茶菌发酵饮料进行了抗氧化活性方面的功能比较。

    样品A:自主研发产品,红茶菌A4菌种发酵,实验时已在常温存放至少6个月,滋气味与外观均未发生改变,颜色最深,深褐色。

    样品B:红茶菌混合菌株发酵饮料,市售,货架期较长,为12个月,常温保存,310 mL塑料瓶包装,不透明,入口后酸味刺激,回味甜,颜色居中,褐色,实验时已有5个月货架期,形态仍比较稳定,未见异常;

    样品C:红茶菌混合菌株发酵饮料,市售,货架期较短,为15 d,需0~7 ℃冷藏,300 mL玻璃瓶包装,存放6 d左右后瓶内出现菌膜,略有异味,味道加酸,颜色最浅,浅褐色,饮料中含气,形态不稳定。

    样品D:红茶菌混合菌株发酵饮料,市售,声称内含野生沙棘,1 000 mL玻璃瓶包装,瓶内含有黄色悬浮物,会挂在液面处的玻璃瓶内壁,颜色居中,褐色。

    2.5.1 DPPH清除能力

    从图4中可以看出,4种红茶菌发酵饮料均对DPPH自由基具有较强的清除能力,各样品的清除率均在90%以上。其中自主研发的DPPH自由基清除率虽未名列第一,但是经过Tukey数据分析,各个样品间差异并不显著,说明从各个样品的DPPH 自由基清除率并不能比较出哪种产品抗氧化性更好。

    图4 DPPH自由基清除能力测定
    Fig.4 The measurement of Scavenging activity on DPPH free radical

    表6 DPPH自由基清除率的Tukey多因素检测

    Table 6 Tukey’s multiple comparisons test on DPPH

    2.5.2 超氧阴离子清除能力

    从图5中可看出,样品A的清除率处于最高水平,可达70%以上,高于其他3个样品;其中样品B的·O2-清除能力最弱,低于50%。根据Tukey数据分析,各个样品间差异显著,说明自主研发的产品对于的清除能力最强。

    图5 超氧阴离子清除能力测定
    Fig.5 The measurement of scavenging activity on ·O2-

    表7 超氧阴离子清除率的Tukey多因素检测

    Table 7 Tukey’s multiple comparisons test on ·O2-

    2.5.3 羟基自由基清除能力

    从图中6可看出,样品A的OH·清除率最高,可达95%以上,高于其他3个样品;其中样品B的OH·清除能力最弱,低于50%。根据Tukey数据分析,样品A与样品B间存在显著性差异,与样品C及样品D间差异不显著。说明,自主研发的产品的OH·清除能力优于样品B但与样品C和样品D无可比性。

    图6 羟基自由基清除能力测定
    Fig.6 The measurement of Scavenging activity on OH·

    表8 羟基自由基清除率的Tukey多因素检测

    Table 8 Tukey’s multiple comparisons test on OH·

    3 结论

    以红茶茶汤(质量分数0.5%)、蜂蜜(质量分数6.54%)作为发酵底物,课题组分离的红茶菌葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp., A4)10%进行发酵,静置于30 ℃环境下4~5 d得到发酵原液。发酵液较发酵前溶液总糖减少,总酸增加、pH降低,菌株代谢产出已证实具有功能因子D-葡萄糖二酸1,4-内酯(D-Saccharic acid 1,4-lactone monohydrate, DSL),并经气相色谱仪定性定量测得浓度为0.390 mg/mL,为有效浓度范围内。发酵原液在经离心、抽滤、调配、罐装、密封、杀菌、感官评价等一系列工序后,用87.35%发酵原液、12.24%白砂糖、0.16%柠檬酸、0.25%苹果酸配制成产品。成品不仅具有原料蜂蜜及红茶风味,还有独特的发酵风味,口感酸甜可口,味道醇厚飘香,还具有一定的保健功效,并可以进行工业生产。

    对于产品的功能性定位,主要通过抗氧化性进行评定,与市售的3种红茶菌混合菌株发酵饮料进行DPPH·清除能力清除能力、OH·清除能力3方面的比较。结果显示,自主研发产品具有较强的抗氧化活性:清除DPPH·能力达到90%以上,与其他样品持平;清除·O2-的能力达到70%以上,高于其他市售产品;清除OH·的能力达到95%以上,优于其他3个样品。

    Development on functional fermented beverage with Kombucha A4

    SUN Yu-kun, LI Ya-lin, ZHAO Liang, JI Bao-ping, ZHOU Feng*

    (Beijing Key Laboratory of Functional Food from Plant Resources, College of Food Science & Nutritional Engineering,China Agricultural University, Beijing, 100083, China)

    ABSTRACT:In this study, 0.5% (mass concentration) black tea and 6.54% (mass concentration) honey (with soluble solids content of 76.4%) were used as substrate to fermentGluconacetobacter sp., A4, a strain of Kombucha separated and purified in our laboratory earlier, at inoculum concentration of 10% to develop a new kind of functional beverage. Kombucha could produce functional factor with liver-protecting effect named D-Saccharic acid 1,4 lactone monohydrate (DSL). The beverage with unique flavor and taste was obtained after fermentation at 86 ℉ for about 4-5 days. The fermented liquid was centrifuged, filtrated, mixed, filled into bottle, sealed, and sterilized to obtain industrial product. After sensory evaluation, the final formula of the beverage was determined as follows: 87.35% fermented liquid, 12.24% sugar, 0.16% citric acid and 0.25% malic acid. Finally, compared with three commercially available Kombucha beverages, our product has the highest resistance tooxidation.

    Key words:kombucha; fermentation; functional beverage; oxidation resistance

    DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702025

    第一作者:本科(周峰副教授为通讯作者,E-mail:zf@cau.edu.cn)。

    收稿日期:2016-08-08,改回日期:2016-10-19

    红茶菌的功效与作用